實驗目的：
1.了解并掌握原代細胞培養的相關原理
2.了解并掌握小鼠肝細胞原代培養的方法
實驗器材：
二氧化碳培養箱、光學顯微鏡、無菌操作臺、恒溫水浴鍋、酒精燈、培養皿、燒杯、鑷子、酒精棉、離心管、電動移液器、移液管、細胞計數板、幼鼠、DMEM培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、0.125%胰蛋白酶(含0.1%膠原酶) 、D-Hanks或者PBS等。
原代培養是從供體中取得組織或細胞后在體外進行的培養。原代培養不僅是建立各種細胞系的開始，也是從事組織或細胞培養工作人員應熟悉和掌握的基本的技術。原代培養的組織或者細胞的生物學特性沒有發生很大變化，仍具有二倍體遺傳物質，接近和反映體內生長特性，很適合作藥物測試、基因表達測試、細胞分化等實驗研究。
原代培養是獲取細胞的主要手段，但原代培養的組織由多種成分組成，比較復雜，即使同一類型細胞如成纖維樣細胞或上皮樣細胞，細胞間也存在很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個體差別也可以在細胞上反映出來。因而原代細胞的部分生物學特征尚不穩定，如要做較為嚴格的對比性實驗研究，還需要對原代培養的細胞進行短期傳代后再進行(需要注意的是有些細胞在傳代后可能會發生一些生物學特性的變化)。一般采用2-5代的細胞進行實驗。當然特殊情況和一些終端分化細胞如神經細胞、巨噬細胞、心肌細胞除外。
原代培養的方法很多，基本和常用的為組織塊原代培養法和離散細胞原代培養法(消化法)。
組織塊原代培養：
組織塊原代培養法是原代細胞培養常用的基本方法，適用于各種組織的原代培養，特別是難以消化的組織，組織塊原代培養法操作程序簡單，培養前不經過酶液處理，細胞損傷較小。但由于培養過程中細胞移動受到較大限制，完成原代培養所需的時間較長。
組織塊培養的程序一般為：
1.組織塊修整：將組織塊用平衡緩沖液反復沖洗，然后在滅菌的培養皿中剪碎至碎塊的直徑小于1mm²。
2.貼壁：將組織塊間隔(小塊之間的間隔為1cm)放在培養皿中，培養基需要浸沒組織塊底部但不能使組織塊浮起。
3.培養：通過生長繁殖，細胞可以從組織塊邊緣向四周游出，終生長繁殖連成片，原組織塊可以*消失。
離散細胞原代培養：
動物細胞在體內有嚴密的組織結構，多數組織的形態是固體結構，細胞與細胞或者細胞與細胞間質之間聯系緊密，要得到大量的離散細胞就必須進行人工分離(消化培養)。也有部分組織的細胞自然狀態下就是松散的，從體內取出后不用處理(如血細胞)或稍加處理(如脾細胞)就可以得到細胞懸液。細胞離散后由于每個細胞都能與支持物接觸，營養供應均勻，因此適應快、增殖快、建系快。
通常的離散細胞原代培養步驟為：取材、剪切、消化、接種。
原代培養的細胞往往在制備時含有很多細胞種類，這就需要對分離的細胞進行純化，細胞純化分為懸浮細胞純化和貼壁細胞純化。
懸浮細胞純化多使用密度梯度離心法和表面抗原法(需要固化的抗體，如各種細胞分離柱)。
貼壁細胞純化通常是細胞貼壁法(依據貼壁的快慢)和酶消化法(依據貼壁的細胞對消化酶的敏感程度不同)
肝臟是由肝細胞組成，肝細胞極小，肉眼看不到，必須通過顯微鏡才能看到。人肝約有25億個肝細胞，50個肝細胞組成一個肝小葉，因此人肝的肝小葉總數約有50萬個。肝細胞為多角形，直徑約為20微米，有6-8個面，不同的生理條件下大小有差異，如饑餓時肝細胞體積變大。每個肝細胞表面可分為竇狀隙面、肝細胞面和膽小管面三種。肝細胞里面含有許許多多復雜的細微結構：如肝細胞核、肝細胞質、線粒體、內質網、溶酶體、高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成。
肝細胞具有多種功能且代謝旺盛，離體培養的大鼠肝細胞用于毒理學、藥理學、生物化學及致癌作用等研究有許多優點。醫學上常培養肝細胞作為理想的體外模型，在肝病研究、護肝藥物的研發等諸多方面發揮著日益重要的作用。但肝細胞在體外增殖能力差，原代培養難以成功，故在一定程度上限制了肝細胞培養的廣泛開展。制備離體肝細胞常用的方法有非酶分離細胞法、離體肝臟酶消化分離法以及在體肝臟酶灌注法。
實驗步驟：
1.在玻璃培養皿中裝滿冰后倒置成冰臺，同時取3個60mm培養皿，加入2毫升預冷的PBS， 標記上1、2、3(1號和2號培養皿需要放在冰臺上使用) 。
2.將麻醉過的小鼠平放在解剖臺上，用乙醇擦洗其胸部及腹部。在小鼠的肋骨下沿胸骨方向剪一口，摘除小鼠的肝臟并轉移到1號培養血中(注意一定不要弄破內臟，以免帶來嚴重污染，解剖工具必須泡在75%乙醇中，用過即洗)，剔除心臟上的結締組織和血塊后轉入2號培養皿。
3.*清洗肝臟后轉入3號培養m(用注射器沖洗肝臟內部至肝臟呈灰白色)
4.用解剖剪把肝臟切碎成1mm?大小后把含有組織塊的溶液轉入15毫升離心管。5.靜置靜置待組織沉淀后棄上清，加入5毫升胰蛋白酶，37℃孵育5分鐘后加入兒滴胎牛血清終止消化。
6.用注射器的橡膠頭輕輕研磨組織塊成糊狀，把含有組織的溶液用200目的尼龍篩網過濾到新的離心管中。
7.1000轉離心5分鐘， 緩慢吸去上清， 用DMEM重懸后， 1000轉離心5分鐘， 盡量消除殘留的胰酶(操作在細胞間的超凈工作臺中進行)。
8.加入含20%胎牛血清的*培養基重懸沉淀后，把肝細胞鋪到培養皿中，于二氧化碳培養箱37℃、5%COz條件下培養， 24小時換液， 以后每2天換液(操作在細胞間的超凈工作臺中進行)
肝細胞接種培養4小時即可看到有部分細胞貼壁，24小時后細胞已基本貼壁，這時可以換液除去血細胞，3天左右培養瓶中出現成群的新生細胞集落并向周圍生長。
肝細胞剛接種時有兩種形狀：一種體積較小胞漿顆粒較多；一種體積較大胞漿透明。兩種細胞均為圓形或橢圓形，培養5天時，細胞貼壁牢固，體積明顯增大，仲展生長成上皮樣并相互連接融合成片。一般為了幫助細胞貼附可以在培養器皿上先涂上一層膠原或者一些促貼附成份(如Matrix等)
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