各種細菌具有各自*的酶系統,因而對底物的分解能力不同,其代謝產物也不同.用生物化學方法測定這些代謝產物,可用來區別和鑒定細菌的種類.利用生物化學方法來鑒別不同細菌,稱為細菌的生物化學試驗或稱生化反應.生物化學試驗的方法很多,這里主要介紹碳水化合物的代謝試驗
1．糖(醇、苷)類發酵試驗
(1)原理:不同種類細菌含有發酵不同糖(醇、苷)類的酶,因而對各種糖(醇、苷)類的代謝能力也有所不同,即使能分解某種糖(醇、苷)類,其代謝產物可因菌種而異.檢查細菌對培養基中所含糖(醇、苷)降解后產酸或產酸產氣的能力,可用以鑒定細菌種類.
(2)方法:在基礎培養基中(如酚紅肉湯基礎培養基pH7.4)加入0.5~1.0％(w/v)的特定糖(醇、苷)類.所使用的糖(醇、苷)類有很多種,根據不同需要可選擇單糖、多糖或低聚糖、多元醇和環醇等,見表6-4-1.將待鑒定的純培養細菌接種入試驗培養基中,置35℃生化培養箱內孵育數小時到兩周(視方法及菌種而定)后,觀察結果.若用微量發酵管,或要求培養時間較長時,應注意保持其周圍的濕度,以免培養基干燥.
(3)結果:能分解糖(醇、苷)產酸的細菌,培養基中的指示劑呈酸性反應(如酚紅變為黃色),產氣的細菌可在小倒管(Durham小管)中產生氣泡,固體培養基則產生裂隙.不分解糖則無變化.
(4)應用:糖(醇、苷)類發酵試驗,是鑒定細菌的生化反應試驗中主要的試驗,不同細菌可發酵不同的糖(醇、苷)類,如沙門菌可發酵葡萄糖,但不能發酵乳糖,大腸埃希菌則可發酵葡萄糖和乳糖.即便是兩種細菌均可發酵同一種糖類,其發酵結果也不盡相同,如志賀菌和大腸埃希菌均可發酵葡萄糖,但前者僅產酸,而后者則產酸、產氣,故可利用此試驗鑒別細菌.
2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗
(1)原理:細菌在分解葡萄糖的過程中,必須有分子氧參加的,稱為氧化型;能進行無氧降解的為發酵型;不分解葡萄糖的細菌為產堿型.發酵型細菌無論在有氧或無氧環境中都能分解葡萄糖,而氧化型細菌在無氧環境中則不能分解葡萄糖.本試驗又稱氧化發酵(O/F或Hugh－Leifson,HL)試驗,可用于區別細菌的代謝類型.
(2)方法:挑取少許純培養物(不要從選擇性平板中挑取)接種2支HL培養管中,在其中一管加入高度至少為0.5cm的無菌液體石蠟以隔絕空氣(作為密封管),另一管不加(作為開放管).置35℃生化培養箱孵育48h以上.
(3)結果:兩管培養基均不產酸(顏色不變)為陰性;兩管都產酸(變黃)為發酵型;加液體石蠟管不產酸,不加液體石蠟管產酸為氧化型.
(4)應用:主要用于腸桿菌科與其它非發酵菌的鑒別.腸桿菌科、弧菌科細菌為發酵型,非發酵菌為氧化型或產堿型.也可用于鑒別葡萄球菌(發酵型)與微球菌(氧化型).
3．甲基紅(MR)試驗
(1)原理:某些細菌在糖代謝過程中,分解葡萄糖產生丙酮酸,丙酮酸進一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等,使培養基pH下降至4.5以下時,加入甲基紅指示劑呈紅色.如細菌分解葡萄糖產酸量少,或產生的酸進一步轉化為其它物質(如醇、醛、酮、氣體和水),培養基pH在 5.4以上,加入甲基紅指示劑呈桔黃色.
(2)方法:將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中,35℃生化培養箱48h~96h后,于5ml培養基中滴加5~6滴甲基紅指示劑,立即觀察結果.
(3)結果判定:呈現紅色者為陽性,桔黃色為陰性,桔紅色為弱陽性.
(4)應用:常用于腸桿菌科內某些種屬的鑒別,如大腸埃希菌和產氣腸桿菌,前者為陽性,后者為陰性.腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性,而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性.
4．β－半乳糖苷酶試驗(ONPG試驗)
(1)原理:乳糖發酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解.有些細菌只有半乳糖苷酶,因而只能遲緩發酵乳糖,所有乳糖快速發酵和遲緩發酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG)而生成黃色的鄰硝基酚.用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別.
(2)方法:將待試菌接種于ONPG肉湯中,35℃水浴鍋或生化培養箱孵育18~24h,觀察結果.
(3)結果:呈現亮黃色為陽性,無色為陰性.
(4)應用:可用于遲緩發酵乳糖細菌的快速鑒定,本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細菌均可短時間內呈現陽性.埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性,而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性.
5．VP試驗
(1)原理:測定細菌產生乙酰甲基甲醇的能力.某些細菌如產氣腸桿菌,分解葡萄糖產生丙酮酸,丙酮酸進一步脫羧形成乙酰甲基甲醇.在堿性條件下,乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰,進而與培養基中的精氨酸等含胍基的物質結合形成紅色化合物.即V-P試驗陽性.
(2)方法:將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中,35℃生化培養箱24~48h,加入50g/Lα－萘酚(95％乙醇溶液)0.6ml,輕輕振搖試管,然后加0.2ml 400g/L KOH,輕輕振搖試管30s至1min,然后靜置觀察結果.
(3)結果:紅色者為陽性,黃色或類似銅色為陰性.
(4)應用:主要用于大腸埃希菌和產氣腸桿菌的鑒別.本試驗常與MR試驗一起使用,一般情況下,前者為陽性的細菌,后者常為陰性,反之亦然.但腸桿菌科細菌不一定都這樣規律,如蜂房哈夫尼亞菌和奇異變形桿菌的VP試驗和MR試驗常同為陽性.
6．膽汁七葉苷水解試驗
(1)原理:在10%~40％膽汁存在下,測定細菌水解七葉苷的能力.七葉苷被細菌分解生成的七葉素,七葉素與培養基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子發生反應形成黑色化合物.
(2)方法:將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養基中,35℃生化培養箱18~24h后,觀察結果.
(3)結果:培養基*變黑為陽性,不變黑為陰性.
(4)應用:主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區別,以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌(如脆弱擬桿菌等)的初步鑒別.D群鏈球菌本試驗為陽性.
7．淀粉水解試驗
(1)原理:產生淀粉酶的細菌能將淀粉水解為糖類,在培養基上滴加I液時,可在菌落周圍出現透明區.
(2)方法:將被檢菌劃線接種于淀粉瓊脂平板或試管中,35℃生化培養箱18~24h,加入革蘭I液數滴,立即觀察結果.
(3)結果:陽性反應,菌落周圍有無色透明區,其它地方藍色;陰性反應,培養基全部為藍色.
(4)應用:用于白喉棒狀桿菌生物型的分型,重型淀粉水解試驗陽性,輕、中型陰性;芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定.
8．甘油復紅試驗
(1)原理:甘油可被細菌分解生成丙酮酸,丙酮酸脫去羧基為乙醛,乙醛與無色的復紅生成醌式化合物,呈深紫紅色.
(2)方法:取被檢菌接種于甘油復紅肉湯培養基中,于35℃生化培養箱,觀察2~8d.應同時做陰性對照.
(3)結果:紫紅色為陽性,與對照管顏色相同為陰性.
(4)應用:主要用于沙門菌屬內各菌種間的鑒別.傷寒沙門菌、甲(丙)型副傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、孔道夫沙門菌和仙臺沙門菌本試驗為陰性,乙型副傷寒沙門菌結果不定,其它不常見沙門菌多數為陽性.
9．葡萄糖酸氧化試驗
(1)原理:某些細菌可氧化葡萄糖酸鉀,生成α-酮基葡萄糖酸.α-酮基葡萄糖酸是一種還原性物質,可與班氏試劑起反應,出現棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀.
(2)方法:將待檢菌接種于葡萄糖酸鹽培養基中(1ml),置35℃生化培養箱48h,加入班氏試劑1ml,于水浴中煮沸10min并迅速冷卻,觀察結果.
(3)結果:出現黃到磚紅色沉淀為陽性.不變或仍為藍色為陰性.
(4)應用:主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群.
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