一、目的
學習纖維素薄層層析的操作方法,掌握分配層析的原理。
二、原理
以纖維素作為支持物,把它均勻地涂布在玻璃板上成一薄層,然后在此薄層上進行層析即為纖維素薄層層析。纖維素是一種惰性支持物,它與水有較強的親和力而與有機溶劑親和力較弱。層析時吸著在纖維素上的水是固定相,而展層溶劑是流動相。當欲被分離的各種物質在固定相和流動相中的分配系數不同時,它們就能被分離開。
三、實驗材料、儀器和試劑
1.實驗材料
綠豆芽或萌發小麥種子
2.儀器
燒杯50mL×1;玻璃板5 cm×20cm×1;層析缸;毛細管;噴霧器;研缽。
3.試劑
標準氨基酸溶液:絲氨酸、色氨酸、亮氨酸,分別以0.01mol/L 鹽酸配成4mg/mL 的溶液。
纖維素粉(層析用)或微晶型纖維素(層析用);羧甲基纖維素鈉(CMC)。層析溶劑系統:正丁醇(分析)﹕冰醋酸(分析)﹕水=4﹕1﹕1(V/V)。顯色劑:0.1%茚三酮-丙酮溶液。
四、操作步驟
1.氨基酸的提取
取已萌發好的小麥種子2g(或綠豆芽下胚軸2g),放入研缽中,加95%乙醇4mL 及少量的石英砂,研成勻漿后,倒入離心管中離心3 000r/min、15min,上清液即為氨基酸提取液,用滴管小心吸入點樣瓶中備用。
2.制板
取少量羧甲基纖維素鈉(約12mg),置研缽中充分研磨,再稱取纖維素粉3g 于研缽中研磨,再加入14mL 水研磨勻漿,把纖維素勻漿倒在洗凈烘干的玻璃板上,輕輕震動,使纖維素均勻分布在玻璃板上,水平放置風干,用前放入100~110℃干燥箱中活化30min。此處羧甲基纖維素鈉是起粘合劑作用,它使纖維素粉能較牢固地粘附于玻璃板上,加入量過多會破壞纖維素薄層的毛細作用而使層析速度延緩,加的量過少則粘合不牢固,因此需要注意加量控制。
3.點樣
用刀片將薄層板上薄層的左右各邊刮削掉0.5cm,以防止“邊緣效應”。在纖維素薄板上距一端15mm 處,用鉛筆輕輕劃出點樣記號。樣點之間距離1.3cm。用毛細管吸取樣品,在記號處點樣,樣品斑點直徑控制在2mm 左右。
4.展層
將薄板有樣品的一端浸入已存放展層溶劑的層析缸中,層析溶劑液面不能高于樣品線。待展層溶劑走到距薄板頂端0.5~1cm 時取出此薄板(約1~2h),用鉛筆在前沿處作一記號后用電吹風吹干。
5.顯色
將茚三酮顯色劑噴霧在板上,用熱吹風吹數分鐘,(或置于70~80℃干燥箱中烘干)即可觀察到紫紅色的氨基酸斑點,脯氨酸例外,為黃色斑點。用鉛筆圈出氨基酸斑點,量出溶劑前沿的距離及各斑點中心與起點之間的距離,并計算各氨基酸的Rf 值。Rf 值為遷移率(rate of flow, Rf),在恒定條件下,每種氨基酸有其一定的Rf 值。
根據已知標準氨基酸和Rf 值,與小麥(或綠豆芽)提取液中氨基酸的Rf 值比較,確定提取液中含有哪些種氨基酸。
五、附 注
1.在操作過程中,手必須洗凈,只能接觸薄板上層邊角;不能對著薄板說話,以防唾液掉在板上。
2.配制展層劑時,要用純溶劑,應現用現配,以免放置過久其成分發生變化(酯化)。
立即詢價
您提交后,專屬客服將第一時間為您服務