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【實驗目的】
了解和掌握植物離體線粒體制備的方法。

【實驗原理】
線粒體是進行呼吸氧化作用的細胞器，是能量的轉換器，為了對這個細胞器的結構和功能進行研究，需要把它從細胞中分離出來，并測定其活性。
在接近生物材料自身的生理狀態(合適的pH、一定的滲透濃度和低溫條件)下破碎細胞，可采用分級離心方法將線粒體顆粒與其他細胞內含物在亞細胞水平上分開，然后在一定的離心力下收集線粒體。針對植物組織比較脆弱及其細胞含有較大量的有機酸等特點，不宜采取激烈的破碎方式，根據不同種類材料靈活掌握介質的pH。在介質中加入一些高分子化合物可除去酚類的干擾。為了去除其它細胞器的污染，獲得純凈的線粒體，本實驗采用蔗糖襯墊離心法進行提取。
【儀器設備】
冰凍高速離心機、研缽或、組織搗碎機、制冰機、冰箱、100ml離心管、燒杯、培養皿、恒溫培養箱、移液器、紗布、漏斗、電子天平、容量瓶、磁力攪拌器等。

【材料及試劑】

1. 材料
挑選籽粒飽滿的綠豆種子20g，用沸水燙后，均勻鋪在帶有濕潤濾紙的培養皿中，37℃恒溫培養箱下黑暗萌發3-4d。去掉種皮和胚根，用濾紙吸干表面水分，放在4°C冰箱備用。

2. 試劑
① 提取及洗滌介質：50mmol/LTris-HCl 緩沖液，pH8.0。內含0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、0.2mmol/L二硫蘇糖醇和1mg/mL PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)； ② 懸浮介質：除不加牛血清蛋白外，其余與提取介質相同； ③ 蔗糖溶液：0.6mol/L蔗糖，全用懸浮介質配制。

【實驗步驟】
1. 離體線粒體的提取：稱取10g去除種皮及胚根的綠豆幼苗放在4°C冰箱中饑餓1h，然后迅速在冰浴中研磨，開始加入少量提取介質，后加至材料體積的一倍。

2. 勻漿用4層紗布過慮，濾液在4℃、1000g離心10min。

3. 取上清液，4℃、11000g離心20min。

4. 棄上清液，向沉淀中加入提取介質5mL，懸浮，4℃、11000g離心15min。 5. 棄上清液，收集沉淀，并懸浮于0.5ml懸浮介質中。

6. 加入25mL洗滌介質，4℃、1000g離心10min，取上清液，4℃保存備用。

7. 取一干凈的50mL離心管，加入20mL0.6mol/L的蔗糖溶液，然后將上一步驟中經過低速離心并洗滌過的線粒體懸液鋪在0.6mol/L的蔗糖溶液上，4℃、11000g離心20min，所得沉淀即為純化線粒體，用1ml懸浮介質懸浮，4℃保存備用。

8. 蛋白質含量測定(考馬斯亮藍法)，根據所測定蛋白質含量，用懸浮介質將線粒體懸浮液稀釋成2mg蛋白質/ml線粒體懸浮液，4℃保存備用。

【實驗原理】
氧電極又稱Clark電極，由嵌在絕緣棒上的鉑和銀構成，以氯化鉀溶液為電解質，覆蓋一層15-20mm厚的聚乙烯或聚四氟乙烯薄膜，兩極之間為極化電壓。溶氧可透過薄膜進入電極，在鉑陰極上還原，同時在極間產生擴散電流，此電流與溶解氧濃度成正比。氧電極可以直接測量溶液中溶解氧的濃度，并且對溶液中氧的吸收或釋放所引起的濃度變化十分敏感。具有活性的線粒體，供給底物表現出呼吸耗氧，因此可用氧電極測定線粒體的活性即呼吸強度。