一、 實驗原理
大腸桿菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌。微生物接種的方法有很多,常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。
平板劃線法是通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。在數次劃線后培養,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落。
稀釋涂布平板法則是將菌液進行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面,進行培養。在稀釋度足夠高的菌液里,聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞,從而能在培養基表面形成單個菌落。
二、實驗目的
1、掌握用平板劃線法分離純化大腸桿菌的方法;
2、掌握用稀釋涂布平板法分離純化大腸桿菌的方法。
三、儀器與用具
高壓滅菌鍋,超凈工作臺,接種環,培養皿,酒精燈,試管,玻璃涂布器,pH試紙,微量可調移液器,恒溫培養箱,大腸桿菌,微生物的實驗室培養試劑盒
四、實驗準備
稱取微生物培養試劑盒中的固體培養基6.4g加入200mL水中,加熱充分溶解(可按培養的微生物適合生長條件需要調節pH),121℃高壓滅菌20min待用,可倒平板10個。
稱取2g液體培養基加100mL蒸餾水溶解,調節pH至7.0,121℃高壓滅菌20min,冷卻后在超凈臺接入100μL大腸桿菌菌種,恒溫振蕩器37℃震蕩培養12小時,用滅菌離心管每組分裝1mL實驗備用
五、實驗步驟
1、倒平板操作:
⑴將滅過菌的培養皿放在火焰旁的桌面上,右手拿裝有培養基的錐形瓶,左手打開封口膜。
⑵右手拿錐形瓶,使瓶口迅速通過火焰。
⑶用左手的拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙,右手將錐形瓶中的培養基(約20mL)倒入培養皿,左手立即蓋上培養皿的皿蓋。
⑷等待平板冷卻凝固,大約需要5~10min。然后,將平板倒過來放置,使皿蓋在下,皿底在上。
2、平板劃線操作:
⑴將接種環放在火焰上灼燒,直到接種環燒紅;
⑵在火焰旁冷卻接種環,并打開試管帽;
⑶將試管口通過火焰;
⑷將已冷卻的接種環深入菌液中,沾取大腸桿菌液。
⑸將試管口通過火焰,并蓋上試管冒。
⑹左手將皿蓋打開一條縫隙,右手將沾有菌種的接種環迅速深入平板內,劃三到五條平行線,蓋上皿蓋。注意不要劃破培養基。
⑺灼燒接種環,待其冷卻后,從一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線。重復以上操作,在三、四、五區域內劃線。注意不要將后一區的劃線與一區相連。
3、系列稀釋操作:
⑴將分別盛有9mL水的5支試管滅菌,并按101~105的順序編號。
⑵用移液管吸取1mL培養的菌液,注入第二支試管中。吹吸三次或震蕩,使菌液與水充分混勻。
⑶從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液,注入102倍稀釋的試管中,重復第2步的操作。依次類推,直到完成后一只試管的稀釋。
4、涂布平板操作:
⑴用火焰灼燒涂布器滅菌,然后冷卻8~10s。
⑵取少量菌液(100μL),滴加到培養基表面。
⑶用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。
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