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將質量為20～30mg的一塊瓣膜葉片密封在鋁制器皿中，使用裝配有液氮低溫附件的Perkin-Elmer DSC2儀器測量。以1.25K/min的速度冷卻到173K，在以40K/min的加熱速度過程中，記錄溫度，得到溫度-熱流圖如圖5-22所示。由圖中數據得出，玻璃化轉變溫度T_g為-83℃。

心臟瓣膜的凍干實驗是在一種實驗型快速凍干儀器中進行的，其結構如圖5-23所示。 

將冷阱浸在硅樹脂油的冷浴中冷卻到-70℃，用旋片泵維持真空度，用麥氏計來測量真空度，可以達到0.005mmHg。

三個瓣膜葉片用一種單纖維尼龍絲系在一小塊PVC塑料網上，裝在一個Falcon塑料管中。大多數實驗中，Falcon塑料管浸在液氨或控制了溫度的硅樹脂油中，瓣膜葉片在冷空氣環境下冷凍。冷卻Falcon塑料管的冷浴的溫度為-15℃、-40℃、-80℃或者-196℃。然后，將Falcon塑料管從低溫液體中取出，快速地放入凍干機的凍干箱里；少數實驗中瓣膜葉片被直接浸入-60℃或者-80℃的酒精浴冷凍。樣品的凍結速率數據列于表5-13中。在葉片角落里粘有一個與圖表記錄器相連接0.12mm的銅鎳合金，用于測量溫度。凍干室初始溫度為室溫22℃，然后通過浸在-20℃或-30℃的恒溫浴里控制溫度。之后，自然升溫，此為非控制凍干。

真空干燥連續進行3h，這時葉片溫度穩定在室溫(22℃)。通過SEM對這些葉片的部分進行檢查顯示出預期的多孔結構，如圖5-24所示?？资怯衫鋬鲋行纬珊透稍镏序尦谋w產生的。而且有一個規律，冷卻速度越低孔越大[對比圖5-24(a)和(b)]，但不連續，每個樣品也不一樣[如圖5-24(b)的例子]。葉片的厚度與冷卻速度有直接聯系。因為大多數孔的尺寸顯得比預期的要小得多，可以嘗試著在干燥前對葉片熔化和再冷凍，這樣可以提高冰孔的尺寸。其他更多的葉片以6℃/min的速度冷卻，在溫度為37℃的水浴里熔化，然后以相同的速度再冷凍，三個以上再以72℃/min的速度冷卻，但是它們產生了與僅僅經過一次冷凍的葉片相似的SEM外形。

另一個問題就是稠密層的出現，許多樣品表面很顯然沒有孔[見圖5-24(b)]；SEM圖片顯示葉片表面是壓實的，內部孔和外部很少連通[見圖5-24（c）]；在葉片物質內部同樣出現了緊湊層[見圖5-24(d)]。這些現象顯示了在干燥過程中發生了廣泛的坍塌，可能是在干燥過程中溫升較快造成的。在處理結束，葉片的含水量很少，很可能是發生了熔化和蒸發，而不是升華。因此后面進行了嚴格的控制冷凍干燥實驗。

在控制冷凍干燥過程中，選擇了兩種冷凍方法：將Falcon試管放在-40℃的冷浴里(平均冷卻速度為6.7℃/min)，或者是放在196℃的液氮里（平均冷卻速度為51℃/min)。將干燥燒瓶放在設定溫度的冷浴里6h，它的溫度就被控制在-20℃或-30℃；6h后關掉冷藏室，讓浴溫自動上升。測量的溫升速度是0.06～0.08℃/min，從-20℃達到0℃需要5h，從-30℃到達0℃需要6.3h?？偟恼婵崭稍飼r間需要16h，最終溫度為5～11℃。每個實驗方案凍干了三個葉片，然后經過SEM檢驗。從8個瓣膜里得到的24個葉片都經過相同的處理，在干燥處理過程中或結束后和再水化后測量水的含量。結果顯示在-30℃時的干燥速度是很慢的，20℃時盡管在那個階段的最后將干燥時間從6h延長到12h可以保證水的含量很低，但是它對最后剩余水氣沒有影響。更多的研究是在為-20℃或-30℃溫度下干燥6h的初始干燥后，再以0.06℃/min的加熱速度進行第二次干燥，整個過程需要16h。

SEM照片（見圖5-25）顯示，-20℃干燥的葉片有更好的外觀，多孔基體更統一，沒有坍塌的區域和厚的、稠密的邊界層?？椎某叨缺确强刂评鋬龈稍锏娜~片看上去大很多[比較圖5-24(a)和圖5-24(b)與圖5-25(a)和圖5-25(b)]。凍結速率為7℃/min的葉片孔顯得比50℃/min的葉片的孔稍大而且更均勻。-30℃干燥的葉片表面外殼更厚一些，顯示了在第二個干燥階段中已經發生了坍塌。這是由于在最初的溫度為-30℃干燥6h后，有更高的水含量。所以，起初干燥的溫度最好是-20℃。但是，在兩種情況下，表面都缺乏明顯的與內部多孔基體相連通的孔。

為了確定從SEM檢查得到的壓痕數量，測量了凍干葉片的厚度和孔的尺寸。圖5-26顯示了對兩種冷卻速度的數據比較，一種是非控制快速干燥，另一種是-20℃的控制干燥。不考慮干燥方法的影響，快速冷凍后葉片變得更厚了；同樣，不考慮冷卻速度的影響，控制干燥的葉片也更厚了。假如避免了崩塌，對于兩種冷卻速度，沿著垂線方向從內流到外流表面的冰孔數量相似。對分別經過1℃/min、5℃/min、25℃/min冷卻速度的冷凍，然后進行初始干燥溫度為-20℃的冷凍干燥的葉片，通過SEM測量了其孔的截面積的分布。在兩個垂直方向上進行了表面觀察，第一個是半徑方向，即從容器表面指向容器中心；第二個切線方向與第一個方向成90°，即它與容器表面的切線平

行。結果如圖5-27所示?？梢钥闯隼鋮s速度(1℃/min)低，凍干樣品冰孔尺度分布廣，而且在斷面的兩個方向上沒有顯著的差別；冷卻速度快則凍干樣品冰孔尺度分布窄，而且切線方向上比半徑方向上孔徑更大，也就是說，冰晶體形成于切線方向。經測量，在兩種冷卻速度下，大多數冰孔半徑方向上面積為100～350μm²，但是冷卻速度為5℃/min的比25℃/min孔徑稍長，樣本的橫斷面積分別為400μm²和200μm²。凍干工藝為：以5℃/min的冷卻速度，然后在-20℃真空干燥6h，接著在緩慢的加熱過程中進行二次干燥，得到的凍干多孔葉片殘余水分為8%～9%，內部孔的測量尺寸為100～350μm²。這對橫斷面積為150-200μm²的纖維原細胞提供了足夠的通道。因此，在后來的所有研究中都采用了上述葉片凍干工藝。

SEM未能回答的問題：“內部冰孔與孔之間是互相連通，還是它們是獨立封閉的？"為了回答這個問題，干燥前對葉片涂上熒光素，然后再用甲基安息香酸鹽進行清洗后對它進行顯微鏡共焦掃描(CSM)，結果顯示它的結構與開放的塑料泡沫相似。不過，SEM和CSM都暗示內部的多孔結構很少與表面聯通。圖5-28(a)和(b)顯示了SEM的外觀，流入表面上的凹陷很小(10~20μm),顯得與內部的多孔結構不連通。CSM同樣揭示了表面的口袋狀結構，盡管橫向連通的可能性不能被全部排除，但是它們似乎是封閉。

然而，當葉片被放置在玻璃皿上，大部分流人表面朝上，用1根8×20號手術針就可以創造出三角形的穿孔，直徑尺寸為75~100μm[見圖5-28(c)和(d)]，穿透了流出表面，孔徑小于10μm。

ALAN的這項研究主要針對的是他提出的凍干瓣膜應具備的第一項功能：提供多孔結構，以便當使用瓣膜將其懸在介質中復水時，能允許纖維原細胞迅速進入瓣膜內部。