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　摘要：結合國外糞大腸菌群的酶底物檢測方法，針對某次突發環境污染事件，用酶底物法和標準多管發酵法同步檢測受污染地表水中的糞大腸菌群，討論酶底物法在應急檢測中檢測糞大腸菌群的適用性。結果表明，兩種方法的測定數據顯著相關，沒有統計學差異ρ＞0.05。相對于多管發酵法，酶底物法特異性強，檢測時間短，二次污染少，符合應急檢測的要求。
應急監測指突發環境事件發生后,對污染物種類、濃度和污染范圍進行的監測。
糞大腸菌群又稱耐熱大腸菌群,是水質污染的重要指標之一,也是環境質量標準和排放標準中*的控制指標之一。快速、準確地檢測糞大腸菌群直接關系突發水環境污染事件中水體的糞便污染評價,以及采取的應急措施和生活用水的安全。
在目前國內已頒布的相關標準中,糞大腸菌群檢測多選用經典方法多管發酵法和濾膜法,操作較繁瑣,需要48h~72h才能獲得結果,難以滿足突發性環境污染事故監測及時、準確的要求。酶底物法是一種新型酶技術檢測方法,2003年從美國引入我國,用于大腸桿菌檢測。該方法利用糞大腸菌群在44.5℃生長過程中產生的β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解培養液中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),使培養液呈現黃色反應(陽性),從而指示糞大腸菌群的存在。
在美國,90%以上的實驗室使用酶底物檢測技術;在加拿大、日本的飲用水市場,酶底物法的使用率高于其他檢測方法的總和;在我國,該法也日益普及,擁有相關設備的各級環境監測站達百余家,目前已作為檢測水中總大腸菌群的標準方法列入《生活飲用水衛生標準》(GB5749-2006)。使用酶底物法檢測水中糞大腸菌群尚未正式列入國家標準,使酶底物法的應用范圍受到限制。
為了建立糞大腸菌群簡單、準確的快速檢測法,以標準中的Colilertech酶底物法為基礎,通過某水體一次污染事故中糞大腸菌群的連續監測過程分析,將酶底物法與多管發酵法作比對,探討糞大腸菌群酶底物快速檢測法在應急監測中運用的可行性,為酶底物法行業標準的編制提供技術參考。
1研究方法和設備
1.1儀器高壓滅菌器1臺,培養箱2臺,立科封口機,移液器,振蕩器等。
1.2樣品水樣來源于受污染的地表水,按照《水質采樣技術指導》(HJ494-2009)的規定采集約
500mL水樣,置于滅菌采樣瓶中,在0℃~4℃低溫保存,送至實驗室分析。
1.3檢測方法
1.3.1酶底物法基于標準中的Colilertech酶底物法,培養基由西安立科公司提供。目前立科酶底物培養基已經獲得《水和廢水標準檢驗法》認可。檢測時用100mL無菌稀釋瓶量取100mL水樣,加入(2.7±0.5)g培養基粉末,混搖均勻使其*溶解后,全部倒入97孔無菌定量盤內,用立科封口機封口,放入培養箱中于(44.5±1)℃培養24h后判讀結果。
2試驗結果和分析
2.1試驗結果共采集124個水樣,分別用酶底物法和多管發酵法測定糞大腸桿菌,結果見圖1,線性回歸分析見圖2。由圖2可見,兩種方法的測定數據在指數水平上呈現明顯的一致性,測定結果之間有較好的趨勢性,線性回歸方程為y=1.3355x-209.77,R2為0.7588,相關性較為顯著。


2.2可信度檢驗分別用NSI公司和ERA公司提供的糞大腸菌群質控標樣,對酶底物法和多管發酵法進行方法質控,陰性檢測和陽性檢測的結果見表1。由表1可見,酶底物法和多管發酵法的檢測結果均在質量控制可信度區間內,可用于后續實驗分析。
2.3兩種方法比對分析運用SPSS17.0統計軟件,對酶底物法和多管發酵法做配對t檢驗分析,結果見表2。表1兩種方法的可信度檢驗MPN/100mL方法檢測結果QC值置信范圍結果評判酶底物法(NSI公司)579681182~2560良好多管發酵法(ERA公司)490797346~1250良好表2兩種方法的t檢驗結果Table2ttestofthetwomethods成對差分均值標準差均值的標準誤差差分的95%置信區間下限上限t值dfP值-0.044200.663800.05961-0.162200.07379-0.7421230.460

由表2可見,兩種方法的相關度為0.836,P值為0.460,表明二者相關性良好,兩種方法無顯著性差異。
因此,將酶底物法用于環境中糞大腸菌群檢測,方法可行,結果可信。
2.4環境標準判讀根據《地表水環境質量標準》(GB3838-2002),對124個樣品的酶底物法和多管發酵法檢測結果作標準評判比較,變化率為0.8%~6.5%,在可接受范圍內(見表3)。此次被檢樣品的水質介于Ⅱ類~Ⅴ類之間,與上海地區地表水糞大腸菌群評價結果的范圍基本一致。表3酶底物法和多管發酵法的標準評判比較

水質標準類別Ⅰ類Ⅱ類Ⅲ類Ⅳ類Ⅴ類(劣Ⅴ類)酶底物法樣品數n/個7702423占比/%5.656.519.418.5多管發酵法樣品數n/個5632531占比/%4.050.820.225.03討論從結果一致性的角度,酶底物法與多管發酵法沒有統計學意義上的差異,此次樣品檢測結果與文獻報道的多管發酵法與酶底物法的比對試驗結果具有較好的一致性。從檢測原理上分析,多管發酵法主要基于糞大腸桿菌分解乳糖產酸產氣的生化原理,而酶底物法則應用酶技術,利用糞大腸桿菌產生β-半乳糖苷酶,分解鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷使培養基顯色的原理檢測,反應專性更強。因此,相對于多管發酵法15%的假陽性和10%的假陰性,酶底物法出現假陰性和假陽性的現象較少,僅占2%。從實驗操作的角度,多管發酵法需要重復接菌,造成污染的幾率較大,而酶底物法取樣加藥后封口培養,過程簡單,較少受人為污染。

從檢測結果分析,雖然二者均采用較大可能數法,但多管發酵法的較大可能數表僅有56組,該試驗采用的酶底物法97孔定量盤的較大可能數表有2352組,其統計概算結果更加準確。由此可見,與多管發酵法相比,酶底物法操作簡便,檢測速度較快,二次污染少,準確性較高。雖然酶底物法材料成本略高,但綜合考慮管理和人員成本,仍在可接受范圍內,可以作為應急環境監測中微生物污染的快速監測方法。兩種方法的比較見表4。

采用酶底物法檢測糞大腸菌群時,需注意以下幾點:
(1)樣品的均勻性。水樣需搖勻,并盡快與培養基混合,否則可能導致結果差異性很大,喪失方法的穩定性優勢。
(2)稀釋比的合理性。研究發現,水樣稀釋倍數越高,酶底物法的測定值越偏低。因此,在日常檢測工作中,應根據具體情況對水樣做小倍數稀釋,使結果更加準確、真實。
(3)培養溫度的恒定性。樣品在培養箱中于44.5℃培養,誤差控制在±0.5℃,溫度偏低或偏高都直接影響檢測結果。
檢測方法操作步驟場所和人員要求確認實驗檢測時間準確度檢測費用推廣度多管發酵法繁瑣專業場所和人員需要48h~72h較準確較便宜易酶底物法簡易要求不高不需要24h準確較便宜。
4結語
酶底物法以糞大腸菌群的特異性酶與特異性底物產生特異反應為原理,具有檢測快速、準確的特點。方法操作簡便,檢測周期短,能準確判斷水樣受糞便污染狀況,符合突發性環境應急監測實時、快速、準確的要求,將得到更為廣泛和標準化的應用。糞大腸菌群酶底物法在環境應急監測中的應用結合國外糞大腸菌群的酶底物檢測方法,針對某次突發環境污染事件,用酶底物法和標準方法多管發酵法同步檢測受污染地表水中的糞大腸菌群,討論酶底物法在應急監測中檢測糞大腸菌群的適用性。結果表明,兩種方法的測定數據顯著相關,沒有統計學差異(P>0.05)。相對于多管發酵法,酶底物法特異性強,檢測時間短,二次污染少,符合應急監測的要求。