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[摘 要]　 目的 　 目前對新生鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型的研究多采用病理學和生化指標,而缺乏功能評價手段。該研究對新生大鼠HIBD后的行為學改變及其測定方法進行探討,為新生大鼠HIBD的研究提供功能評價的方法。

方法 　24只7日齡新生SD大鼠隨機分為對照組（n=12）和HIBD組（n=12） , HIBD組大鼠予以缺氧缺血,對照組大鼠僅予以假手術。生后3周,兩組大鼠予以T迷宮測試及感覺運動測試對學習記憶、空間能力和感覺運動功能進行評估。然后處死兩組大鼠 ,取腦組織切片行尼氏染色,計數海馬DG區和皮層區單位面積神經元的數目,并對行為學和組織學的結果進行相關分析。

結果 　 在行為測試中, HIBD組大鼠的成績顯著低于正常鼠。在T迷宮測試中,兩組在第3,4d的正確率有顯著差異（P=0.049,P<0.001）,HIBD組的正確率（68.3%±26.2% , 66.7%±15.6% ）顯著低于對照組（86.7%±15.6%,98.3%±5.7%）。在感覺運動測試中 ,與正常鼠比較 , H I BD鼠在足錯誤和肢體放置測試中表現出左右運動的不對稱 （均 P < 0 . 001） ,姿勢反射也顯示出了運動功能異常 （ P = 0 . 032）。缺氧缺血導致了神經元損傷 ,使海馬 DG區 （39 . 7 ±5 . 9 vs 50 . 9 ±4 . 1, P < 0 . 001）和皮層單位面積內神經元 （12 . 7 ±3 . 3 vs 18 . 2 ±3 . 3, P < 0 . 001）數目顯著減少。但行為學測試結果與組織學改變無相關性。

結論 　 新生鼠缺氧缺血會造成遠期學習記憶 ,空間能力和感覺運動功能障礙 , T迷宮測試和三項感覺運動測試可以作為大鼠 H I BD模型的評價指標。

[關鍵詞 ]　 缺氧缺血，腦行為學，新生大鼠

　 缺氧缺血性腦病（ hypoxic2ischemic encephal opa2thy, HIE）是新生兒期zui常見的腦損傷病因,也是腦癱、精神發育遲滯、學習障礙和癲癎的常見原因[1]。

Rice法制作的新生鼠缺氧缺血性腦損傷 （ hypoxic2ischemic brain damage, H I BD）模型,采用 7日齡的新生大鼠單側頸總動脈結扎后暴露于低氧環境下制作而成。7日齡的大鼠處于腦發育的高峰期,此時缺氧缺血造成的腦損傷與圍產期窒息造成的足月兒腦損傷相似[2],是研究 H IE損傷機制和保護因素的常用動物模型。對HIBD有保護作用的治療措施除了能減輕神經元損傷外 ,更重要的是應該能改善腦損傷造成的遠期功能改變。然而,目前對HIBD的保護研究多采用病理學和生化指標 ,較少對遠期功能進行評價。在中樞神經系統 ,特別是未成熟腦中,組織的修復和代償機制會影響遠期的損傷情況和功能恢復,因此近期的病理或行為評估不一定和遠期評估的結果一致[ 3, 4 ]。

HIBD是一種彌漫性腦損傷 ,可以造成單側腦皮層、紋狀體和海馬損傷[2,5]。皮層損傷可以導致感覺運動功能受損[4];紋狀體損傷會導致自發運動的改變[5],而海馬損傷則會導致空間記憶和學習能力下降[6]。但在新生鼠HIBD模型中,紋狀體損傷

僅會導致近期自發運動改變 ,在斷奶后 ,這種功能缺陷將會恢復[5]。因此,本研究參照 Balduini[5]和Bona〔4〕的行為學測試方法對大鼠缺氧缺血后遠期的學習記憶、空間能力和感覺運動功能進行評估,為HIBD的干預研究提供評價手段。

1　 材料與方法

1 . 1　 實驗動物及分組

新生清潔級Sprague2Dawley大鼠,雌雄不限,體重在12g以上,隨機分為對照組和HIBD組 ,每組12只。新生大鼠均由母鼠母乳喂養,21日齡時斷奶,雌雄分籠。予以清潔飲食飲水,室溫維持在22℃,予以12h光照,12h黑暗。

1 . 2　HIBD模型制作

H I BD組大鼠7日齡時乙迷吸入麻醉,分離、結扎、斷開左頸總動脈,縫合皮膚后放回母鼠籠恢復2h,而后將之放入8%的氮氧混合氣的37℃恒溫箱2 h。對照組大鼠于7日齡行假手術,僅予分離左頸總動脈,不予以結扎和缺氧。

1 . 3　 行為學測試

均采用雙盲法進行 ,即行測試者不知道動物的分組。

1 . 3 . 1　T迷宮覓食試驗 （T maze test） T迷宮為木制,每條臂寬11 cm,高18 cm,長40 cm,起始臂末端 15 cm處設有閘門。自 22日齡起檢測。在 T迷宮左右兩臂的末端放置一個直徑為 5 cm的器皿 ,內置 40 mg的食物 ,測試動物在 T迷宮中進行 2 d的覓食適應后開始測試。測試分為預備和測試兩個階段。預備階段時 ,任意選擇 T迷宮的一臂 ,用木閘門將之關閉 ,動物只能進入開放的臂內,并將食物吃完 ,然后將之放入起始臂內 ,關 15 s后撤去所有的閘門開始測試 ,在這一階段,動物的后肢進入兩臂中的任一臂就認為是作出了選擇 ,不準再后退。如果動物進入預備階段未進入的臂內 ,就允許其吃完食物后回籠;如果進入已進入過的臂內 ,將其在該臂內關 10 s后回籠。每只動物每日測試 5次 ,每次間隔

15 min,連續 4 d。記錄每日測試的正確率。

1 . 3 . 2　感覺運動功能測試（ sens ori mot or functi ontest） 包括以下三項試驗。待大鼠達34日齡時進行測試。

1 . 3 . 2 . 1　足錯誤（ foot2 faults test） 將大鼠放在水平的金屬網格上（50cm×40cm,每格3cm×3cm,金屬直徑為0.4cm） ,記錄2min爪子落入網格中的次數 ,為排除不同大鼠活動度的差別的影響,只將左右側錯誤次數的差值進行統計學分析。

1 . 3 . 2 . 2　 姿勢反射（postural reflex test）抓住大鼠的尾巴,使之懸掛于距離桌面50cm高處。正常鼠將兩個前肢都伸向桌面 （0分） ,而有腦損傷的大鼠損傷大腦半球對側（右側）的肢體呈屈曲狀 （1分） ,然后將大鼠放在桌上 ,在肩后的側面加壓直到前肢伸直 ,重復數次 ,如果損傷大腦半球對側（右側）的抵抗力減弱為異常 （2分）。

1 . 3 . 2 . 3　肢體放置（li mb2 p lacing test） 記錄大鼠在不同的感覺刺激下左右側前后爪的放置情況,計分標準如下: 0分,爪子放置正確、迅速; 1分,遲緩或不*正確; 2分,不能放置。記錄每只鼠兩側得分的差值。① 將大鼠放于桌面 ,正常情況下大鼠會伸展前爪放于桌上; ②用手指抬起大鼠頭部以避免其看見桌面 ,將大鼠的前肢接觸桌子邊緣檢測前肢的感覺; ③大鼠面向桌子的邊緣檢測前肢的放置。正常鼠將雙前爪放于桌上;而腦損傷鼠對側爪放置錯誤; ④ 檢查者將大鼠握住緩慢向桌子邊緣移動,檢測前、后肢體的放置; ⑤將大鼠放在桌上,輕輕地從側邊將之推向桌子邊緣,正常大鼠會抓住桌子邊緣,而腦損傷大鼠對側的前、后肢可能會掉下來; ⑥同⑤,只是從后面推。

1 . 4　 組織切片及染色

HIBD后4周將大鼠處死, 4%多聚甲醛灌注并取腦組織固定后石臘包埋,制成3μm的石臘切片,脫臘水化后行尼氏染色。取前囟和前囟后3mm部位行尼氏染色,0.1%甲苯胺蘭60℃溫染1min,水洗,70% ,80%酒精脫水,95%酒精鏡下分化,直至細胞核和背景為淡藍或無色,100%酒精脫水,*透明,封片。光鏡下（×200）在相同部位取單位面積計數神經元。

1 . 5　 統計學分析

全部資料用SPSS11.0軟件包統計軟件處理。計量數據以?x ±s表示 ,均數比較用t檢驗;等級資料比較用Mann2 whitney U檢驗。相關分析采pears on相關分析（計量資料）或s pearman相關分析（等級資料）。

2　 結果

2 . 1　 行為學測試

2 . 1 . 1　T迷宮測試　　 各組在連續4 d的試驗中,正確率如表 1所示。隨著天數的增加,對照組正確率逐漸增高,而HIBD組正確率上升不明顯,說明學習能力較差。在第 3, 4 d時,差異有顯著性意義。

2 . 2　 感覺運動功能測試

2 . 2 . 1　足錯誤 　　HIBD組右左差值（3.0±1. 0）較對照組 （ 0 . 7 ±1 . 3）顯著增高 （ t = 2 4 . 841, P <0 . 001） ,說明該組大鼠左右運動不對稱 ,右側 （缺血腦對側 ）差于左側。

2 . 2 . 2　 姿勢反射 　　在姿勢反射測試中各組大鼠得分情況。得分越高提示腦損傷越嚴重。對照組 12例均為 0分 ,而 H I BD組僅 8例為 0分 ,兩組差異有顯著意義 （ Z = 2 2 . 145, P = 0 . 032） 。

2 . 3　 尼氏染色

缺氧缺血導致了神經元損傷 ,使海馬 DG區和皮層單位面積內神經元數目顯著減少 （均 P <0.01） （表3,圖2）。

2 . 4　 組織學與行為學結果的相關分析將 H I BD大鼠海馬 DG區單位面積內神經元數目與 T迷宮測試第 4 d的正確率進行相關分析 ,兩者無相關性 （ r = 2 0 . 043, P = 0 . 896 ）。將 H I BD大鼠皮層區單位面積內神經元數目與三項感覺運動得分之和進行相關分析 ,兩者也無相關性 （ r s =0 . 286, P = 0 . 368）。