線粒體提取試劑盒
英文名稱
mitochondrial extraction kit
規(guī)格
50T ; 100T
儲存條件
四周內(nèi)使用可4℃儲存，長期保存請置于-20℃。冰袋運(yùn)輸
單位
盒

線粒體提取試劑盒

線粒體提取試劑盒

操作步驟：

1. 樣本處理 a. 組織勻漿：稱取100~200 mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等，PBS或生理鹽水沖洗，洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨組織20次； b. 培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：消化細(xì)胞，PBS洗滌，800g離心5~10 min收集細(xì)胞，計數(shù)。每次提取需要5×10⁷個細(xì)胞，加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi)，0℃冰浴研磨30~40次。

2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，1000g 離心5 min。

3. 取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃，1000g再次離心5 min。

4. 取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃， 12,000 g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底。

5. 往線粒體沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃，1000 g 離心5 min。

6. 取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃， 12,000 g 離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底。

7. 用50 -100μL Store Buffer 或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，立即使用或-70℃保存。

注意事項：

1. 為保證獲得完整的線粒體，務(wù)必做到：第一，全程低溫操作；第二，快速；第三，在不破壞亞細(xì)胞器的情況下破碎細(xì)胞，這是制備線粒體的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時較難破壁，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞。

2. 以離心力g計算正確的離心速度，不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計算離心速度。

3. 進(jìn)行Western Blot和2D-膠電泳，可直接加入上樣緩沖液裂解線粒體。 

轉(zhuǎn)速與離心力換算：1.11×10^(-5)×R×(rpm)^2 G為離心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍數(shù)來表示；

[rpm]^２即：轉(zhuǎn)速的平方； 

R為半徑，單位為厘米。