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　　【中國儀器網 行業應用】蛋白質間的相互作用存在于生物體每個細胞的生命活動過程中，互交叉形成網絡，成細胞中一系列重要生理活動的基礎。其中，多數蛋白質是通過與配體分子結合或者是作為1個大的生物復合體的一部分，與細胞完整性維持、遺傳物質復制、基因表達調控、信號轉導、免疫應答等一系列生命過程。研究蛋白質間相互作用的方式和程度，將有助于蛋白質功能的分析、疾病致病機理的闡明和治療和新型藥物的開發等眾多難題的解決。因此，確定蛋白質間相互作用關系、繪制相互作用圖譜已成為蛋白質組學研究的熱點。近年來有許多方法被用于蛋白質相互作用的研究，酵母雙雜交技術，免疫共沉淀技術，串聯親和純化技術，化學交聯技術，蛋白質芯片技術，熒光共振能量轉移技術，噬菌體展示技術等。
 

　　酵母雙雜交技術
 

　　Fields和song等首先在研究真核基因轉錄調控中建立起來的，是在真核細胞中檢測蛋白質與蛋白質之間的相互作用的方法。該系統是通過兩個分別稱之為“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”的融合蛋白形成一個完整的轉錄激活因子，從而激活報告基因的表達，通過在營養缺陷型培養基上生長或呈現顯色反應來檢測系統的功能。酵母雙雜交系統可在全基因組規模上進行蛋白質一蛋白質相互作用高通量的研究。
 

　　免疫共沉淀技術
 

　　免疫共沉淀是利用抗原和抗體的特異性結合以及細菌的Protein A或G特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的現象開發出來的方法。其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結合的結合于Agarose珠上的Protein A或G，若細胞中有與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物——“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein A或G”，經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。然后經免疫印跡或質譜檢測目的蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內與興趣蛋白天然結合的，符合體內實際情況，得到的結果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。
 

　　串聯親和純化技術
 

　　串聯親和純化(TAP)是一種能快速研究體內蛋白質相互作用的新技術，經過兩步特異性親和純化，可快速得到生理條件下與靶蛋白質存在真實相互作用的蛋白質。該技術通過在靶蛋白質一端嵌入一個特殊的蛋白質標簽(TAPtag)，不破壞靶蛋白質調控序列，且靶蛋白質表達量與體內水平相當；經過兩步連續的親和純化獲得接近自然條件的特定蛋白質復合體，后用質譜技術或Edman 降解法進行蛋白質鑒定。與傳統的研究蛋白質相互作用的技術相比，TAP 技術具有周期短、假陽性結果少等優點。
 

　　化學交聯技術
 

　　交聯劑是能在線型分子間起架橋作用從而使多個線型分子相互鍵合交聯成網絡結構的物質。 促進或調節聚合物分子鏈間共價鍵或離子鍵形成的物質。化學交聯劑是能夠和蛋白質反應的帶有雙功能團的化學試劑。通過功能團和氨基酸殘基反應，偶聯兩個蛋白質或者更多的蛋白質形成網狀交聯。功能團決定了交聯劑的反應特異性。 化學交聯試劑捕獲感興趣的發生了相互作用的蛋白質對，結合生物質譜的高解析能力，快速、高通量地獲取蛋白質結構信息。
 

　　蛋白質芯片技術
 

　　蛋白質芯片是一種新型的生物芯片，是由固定于不同種類支持介質上的蛋白微陣列組成，陣列中固定分子的位置及組成是已知的，用未經標記或標記(熒光物質、酶或化學發光物質等標記)的生物分子與芯片上的探針進行反應，然后通過特定的掃描裝置進行檢測，結果由計算機分析處理。
 

　　蛋白質芯片具有以下特點: 1)特異性強。這是由抗原抗體之間、蛋白與配體之間的特異性結合決定的；2)敏感性高。可以檢測出樣品中微量蛋白的存在，檢測水平已達ng級；3)通量高。在一次實驗中對上千種目標蛋白同時進行檢測，效率*；4)重復性好；不同次實驗間相同兩點之間差異很小；5)應用性強。樣品的前處理簡單，只需對少量實際標本進行沉降分離和標記后，即可加于芯片上進行分析和檢測；6)適用范圍廣。適用于包括組織、細胞系、體液在內的多種生物樣品。
 

　　熒光共振能量轉移技術
 

　　熒光共振能量轉移(FRET)是指兩個熒光基團間能量通過偶極一偶極耦合作用以非輻射方式從供體傳遞給受體的現象，可被用于測定分子間的距離。FRET熒光探針主要有熒光蛋白、有機熒光染料、鑭系染料和量子點，FRET方法的特點是適用于活細胞和固定細胞的各類分子，靈敏度和分辨率高，并能清晰成像，直觀地提供蛋白質相互作用的定位和定量信息，因而受到廣泛重視。
 

　　噬菌體展示技術
 

　　噬菌體展示技術是一種親和選擇和基因表達產物相結合的技術，以改造的噬菌體為載體，將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達，融合蛋白將展示在病毒顆粒的表面，而編碼這個融合子的DNA則位于該病毒粒子內，通過檢測病毒內部的DNA來測定融合蛋白序列。噬菌體展示技術使大量隨機多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯系，使得各種靶分子的多肽配體通過一種被稱為淘選的體外選擇程序得以快速鑒定。
 

　　下面舉一個具體的例子來說明酵母雙雜交技術的應用
 

　　酵母雙雜交技術
 

　　水稻條紋葉枯病是東亞地區普遍發生的毀滅性水稻病害，被稱為水稻上的“癌癥”。其病原是水稻條紋病毒(RSV)，RSV 具有*的基因組結構和編碼策略， 它由4條RNA鏈組成，其核苷酸共參與編碼7個蛋白，包括RdRp、NS2、NSvc2、CP、NS3、SP、NSvc4。
 

　　目前，研究蛋白一蛋白相互作用經典的方法當屬酵母雙雜交技術。該技術幾乎能進行整個細胞內的蛋白質相互作用的篩選，包括膜蛋白、轉錄活性蛋白以及定位于不同亞細胞結構的蛋白。它具有簡便、靈敏、、高通量和價格相對低廉的特點。但該方法也存在有一定的局限性。首先，許多已知的相互作用并沒有在大規模的篩選中被鑒定出來，表明這種方法存在這較高的的假陰性，其主要原因有：篩選方法不同檢測到的蛋白間的互作也不同。例如經典的酵母的雙雜交系統只能檢測到核內蛋白，對胞質蛋白和膜蛋白則檢測不到；融合的報告蛋白很可能空間排列受阻，從而影響蛋白的互作；有些蛋白間的互作是瞬間發生的，目前一些方法很難檢測到，的真核生物在酵母中表達的蛋白缺乏轉錄后修飾，因此發生的互作很難檢測到；報告基因的缺陷；RNA聚合酶1的變化等等。其次，假陽性可以反映蛋白質間非特異性相互作用，也就是說捕獲蛋白能與許多不同的誘餌蛋白相互作用，即薪性捕獲，這可能是由于有些蛋白需要與多個蛋白質相互作用才能正常使用其功能，如分子伴侶；同時，誘餌蛋白和捕獲蛋白可能存在自激活能力，不需要發生蛋白質間的互作就能激活報告基因的表達；有些蛋白存在于不同的組織中，或在發育的不同時間表達，或分布在細胞不同的區域，它們在正常情況下不可能發生互作卻被檢測到了，這樣的互作也是一種假陽性。要想檢測雙雜交中篩選到的相互作用是否真實，還需進行其他的驗證實驗再次驗證。除此之外，通過統計學方法可以給每一個相互作用一個可靠度分值，從而能夠排除許多假陽性。
 

　　酵母雙雜交系統的建立，發展和完善為蛋白質組學的發展提供了有效的途徑。隨著后基因組時代的發展，人們對蛋白質結構與功能的研究將不斷深入，這就需要更，更便捷的新的互作系統被開發出來。同時，隨著細胞內大規模的蛋白質動態互作網絡的構建以及生物信息學的飛速發展，蛋白質互作組學必將進入一個全新的發展階段。