Attune®NxT聲波聚焦流式細胞儀采用了模塊設計，能夠配置至多4種激光和14色熒光檢測，適用于多參數(shù)分析 (圖1)，可滿足大多數(shù)實驗設計和實驗室預算要求。Attune® NxT流式細胞儀能夠兼容流式細胞儀中的熒光基團和熒光蛋白，可以與您目前運行的檢測板匹配 (表1)。采用可選的561 nm激光還可檢測多種熒光蛋白 (圖2)。



圖1. 采用Attune®NxT聲波聚焦流式細胞儀對小鼠調節(jié)性T細胞和樹突狀細胞進行多參數(shù) (10色) 分析。 采用FSC/SSC參數(shù) (A，左) 對淋巴細胞設門，在后續(xù)分析中除去表達B220的B細胞 (A，中)。在B220–、CD45.2+設門范圍內，根據(jù)CD3表達水平分析T細胞 (A，右)。根據(jù)輔助受體CD4或CD8 (B，左) 的表達水平將CD3+ T細胞分成兩個群體。在CD4+ T細胞中，有一種抑制性調節(jié)性T細胞亞群可以表達轉錄因子Foxp3和細胞表面標記物CD25 (IL-2Rα) (B，右)。.CD3–細胞中有少量CD11c+ MHCII+群體，它們是專業(yè)的抗原提呈樹突狀細胞(C，左)。脾臟樹突狀細胞可以進一步分為CD11b+和CD8+樹突狀細胞亞群 (C，右)，分別具有不同的抗原提呈特性。
 

圖2. 活細胞熒光蛋白檢測。 采用CellLight®細胞核-GFP (貨號：C10602) 和CellLight®質膜-RFP (貨號：C10608) 同時轉導U-2 OS細胞。采用Attune®NxT聲波聚焦流式細胞儀分析細胞，儀器使用488 nm激光和530/30發(fā)射濾光片及561 nm激光和585/16 nm發(fā)射濾光片。

表1. Attune® NxT聲波聚焦流式細胞儀熒光基團選擇指南。

*不包括適用于PE的黃色激光 (590/40)。
**可以任選各色激光進行側向散射分析(默認為藍色激光)。紫色激光側向散射推薦用于無洗脫/裂解應用。

Attune®NxT聲波聚焦流式細胞儀可以在您需要時提供更高的靈敏度。即便是在1,000 μL/分鐘的高進樣速率下，您也可以維持精確的聚焦。聲波聚焦提供的精確聚焦使研究人員能夠獲得更小的CV值，更好地鑒別模糊信號和背景，從而減少差異，改善信號分離效果 (圖3)。
 

圖3. 不同流速下的靈敏度檢測。在(A) 的傳統(tǒng)流式細胞儀和(B和C) Attune®NxT聲波聚焦細胞分析儀上，采用561 nm激光和(A) 610/20或(B和C) 610/15發(fā)射濾光片，運行熒光微球 (Spherotech Rainbow校準微粒，3.2 μm)。傳統(tǒng)流式細胞儀是在的靈敏度設置下運行 (~12.5 μL/分鐘)。Attune® NxT流式細胞儀采用了2種不同的設置運行：(B) 12.5 μL/分鐘，與傳統(tǒng)流式細胞儀相同，以及 (C) 500 μL/分鐘，進樣量高40x。即便是在流速下，Attune® NxT流式細胞儀亦可提供相當或更佳的結果。

細胞周期分析是必須精確檢測多個細胞群體之間的熒光強度差異的實例之一。采用Attune®NxT聲波聚焦流式細胞儀，不論樣本進樣速率如何變化，都可以地減小結果的差異。您無需再通過放棄通量而獲得靈敏度 (圖4)。

圖4. 采用Attune®NxT聲波聚焦流式細胞儀，可在高進樣速率下地減小數(shù)據(jù)差異。 對Jurkat細胞進行固定，RNA酶處理，并用碘化丙啶（PI）染色，制成濃度為1 x 106個細胞/mL的溶液，以不同的進樣速率在Attune® NxT聲波聚焦流式細胞儀上進行分析。所有圖上左側的峰反映G0/G1期的細胞，右側的峰反映G2/M期的細胞。不論進樣速率如何，Attune® NxT流式細胞儀上G0/G1和G2/M峰的寬度以及CV%都很穩(wěn)定，即便是在1,000 μL/分鐘的進樣速率下也是如此。

少量細胞群體的分析需要多次采集才能獲得準確且值得信賴的結果，這導致其采集時間較長。Attune® NxT聲波聚焦流式細胞儀的樣本運行速率比其他流式細胞儀快10倍——達1,000 μL/分鐘，每次運行能采集2 x 107次，可以快速且準確地檢測稀有細胞，且不影響數(shù)據(jù)質量 (圖5)。

圖5. >100萬活細胞的采集和少量 (0.2%) 樹突狀細胞群的檢測。漿細胞樣樹突狀細胞 (pDCs) 是一種特殊的細胞群，它們在病毒的刺激下可產生大量的I型干擾素，可根據(jù)免疫表型CD19–/B220高/CD317+進行鑒定。利用CD19-Pacific Blue™、CD317-Alexa Fluor® 488、CD45R/B220-PE直標抗體以及SYTOX® AADvanced™ 死細胞染料對小鼠脾細胞進行四色染色。采用SYTOX®AADvanced™ 死細胞染料在活細胞中設門，然后在CD19–細胞中設門。采用CD45R/B220與CD317雙參數(shù)曲線鑒定pDC。利用500 μL/分鐘的采集速度，獲得130萬個總細胞，細胞濃度為7.5 x 107個細胞/mL。漿細胞樣樹突狀細胞被鑒定為雙B220+/CD317+ (右上象限)，占CD19–活細胞的0.851%，全部脾細胞的0.194%。

洗脫并裂解紅細胞 (RBC) 會造成嚴重的細胞損失和損傷。的樣本采集速率使得Attune® NxT流式細胞儀能夠提供無需洗脫/裂解的實驗方案，地避免了細胞損失，簡化了樣本制備 (圖6)。該特性尤其適用于那些濃度較低的樣本，諸如腦脊液 (CSF)、干細胞及細胞數(shù)量較少的稀釋樣本，這些樣品分析的采集時間通常較長。采用Attune® NxT流式細胞儀，即便是稀釋樣本，亦可快速采集，且不影響數(shù)據(jù)質量。可以對諸如小鼠血液和骨髓等難以采集的樣本、細針抽吸樣本或低細胞產量的樣本直接進行熒光標記然后稀釋進樣，無需洗脫或進行紅細胞裂解。在高樣本采集速率下可輕松實現(xiàn)采集——您可在四分鐘內運行至多4 mL樣本。這種樣本制備過程不會出現(xiàn)樣本損失，且可對所有珍貴樣本進行全面檢測。



圖6. 無需樣本制備，且不影響數(shù)據(jù)質量。采用抗體染色五微升全血，孵育，并使用4 mL緩沖液進行稀釋，在Attune®NxT流式細胞儀上分析。紅細胞可以吸收405 nm光線，可實現(xiàn)如中圖所示的側向散射的差異化設門，在該圖中，采用405 nm與488 nm側向散射雙參數(shù)曲線區(qū)分白細胞和紅細胞群體。在該群體中，可采用前向散射與側向散射子曲線圖鑒別淋巴細胞、單核細胞和粒細胞群體，無需熒光標示。

Attune®NxT軟件采用直觀且易于使用的界面，能提供強大的數(shù)據(jù)采集和分析功能 (圖7)。您可以方便地建立、自定義并保存實驗供將來研究之用。自動進行補償，并可根據(jù)補償指南進行設置。

分析軟件為數(shù)據(jù)分析大化設計，其對較大的數(shù)據(jù)組的刷新速度快 (高達2,000萬次/樣本)，當您作出調整時，能夠立即顯示于數(shù)據(jù)曲線上。軟件采用的工具簡化了實驗設置，包括利用濾光片配置管理器進行試劑選擇。您可以從預置或定制試劑下拉菜單中選擇試劑，根據(jù)儀器上的優(yōu)化通道匹配適當?shù)脑噭缓髴糜谇€標志。

圖7. Attune® NxT軟件界面。

Attune® 聲波聚焦細胞分析儀只能用于實驗研究 不得用于人或動物的治療或診斷用途。